了解COVID-19的病理是全球研究的重点。早期的证据表明，呼吸道微生物群在疾病的进展中可能发挥着重要的作用，但目前的研究却无法得出一致性的结果。本研究中，我们基于对表型良好的COVID-19患者和对照组人群的上呼吸道（n = 58）和下呼吸道（n = 35）的微生物群进行分析，结合微生物组测序、病毒载量测定和免疫分析，探究了COVID-19患者呼吸道微生物组研究中的潜在混杂因素。通过研究我们发现，在重症监护室的时间、氧气供给的类型，以及与包括抗生素使用在内的一些相关的治疗方式，是上呼吸道微生物群的主要变异因素，而SARS-CoV-2病毒载量的影响程度较低。COVID-19患者下呼吸道的单细胞转录组学确定了与促炎性免疫细胞存在物理相关的特定口腔细菌，正是由于不同的ICU住院时间以及不同的氧气供给类型会使得一些有利的细菌引起一些炎症表型--正如我们在重症COVID-19患者中所观察到那样，因此在未来的研究中应该对这些情况多加考量

　　基于qRT-PCR检验确诊的COVID-19患者或基于症状学和胸部CT扫描显示的临床疑似COVID-19患者共计58例患者纳入本研究，随后我们纵向分析了这58例患者的上呼吸道微生物群。这些患者均在UZ Leuven（鲁汶大学）医院住院并接受治疗。该队列的患者人口统计学资料见表1。

　　在这些患者中，我们共收集了112份鼻咽拭子（图1a）：并采用515F和806R引物对这些样本进行测序（见方法）。同时对相同的鼻咽试纸样本进行RNA测定以评估SARS-CoV-2病毒的负载量，并采用nCounter法对宿主的免疫细胞群和免疫相关基因的表达进行评估（见方法）。在我们收集到的112份样本中，有101份样品的扩增子reads的数量高于10,000个，可用于在属水平对结果进行进一步分析（图1b，见方法）。通过分析我们发现，整个队列的微生物组以革兰氏阳性葡萄球菌属（Staphylococcus）和棒状杆菌属（Corynebacterium）为主，这些细菌属是鼻腔和鼻咽部的典型细菌属。

　　图1 样本概述及样本的α多样性分析。a代表患者的纵向采集序列（n=58），每条线例患者，其中黄线代表在病房的天数，蓝线代表在ICU中的天数，红点表示出院日期，×表示采集样本进行微生物组分析的时间点；b代表该队列中最丰富的前15个细菌属；c代表在ICU中的时间和SARS-CoV-2的病毒载量对上呼吸道微生物群多样性的影响（去除掉丢失患者后共计89个样本纳入研究）；d代表ICU住院时间和钙卫蛋白基因表达水平与上呼吸道微生物群多样性的相关性（去除掉丢失患者后共计89个样本纳入研究）。2 细菌α多样性与ICU住院时间、SARS-CoV-2病毒载量和钙卫蛋白水平相关

　　首先，基于Shannon多样性指数（SDI，见方法，附表1），我们对所采集的101个样本在属水平上的α多样性进行了分析。基于分析我们发现，不同采样时刻样本的SDI存在显著差异（Kruskal-Wallis检验，p= 0.009），患者入住ICU时以及入住后采集的拭子之间的SDI存在显著差异，这表明提示疾病的发生以及进行治疗会对微生物多样性造成影响（例如，整个ICU住院期间会对患者给予抗生素治疗）。随后，我们对所产生的差异进行了进一步分析，并发现SDI与采样时在ICU的住院时间呈负相关，具体而言，患者在ICU停留时间越长其多样性越低（ρ = -0.53，p = 1.9 * 10-8）。

　　基于广义线性混合模型框架，我们进一步评价了其他临床或疾病相关变量与上呼吸道微生物群多样性的相关性：我们基于自动模型选择算法，对包含多达8种不同解释变量的所有可能模型进行了详尽筛选（见方法）。用于回归SDI的变量包括患者ID（作为随机效应建模）；疾病相关变量，如ICU时间、SARS-CoV-2病毒载量或使用机械通气；以及已知影响微生物群的其他变量，例如给予抗生素（尤其是美罗培南/哌拉西林-他唑巴坦以及头孢曲松）或炎症标志物水平（钙卫蛋白、C反应蛋白）。在所有后续分析中，由于抗生素美罗培南和哌拉西林/他唑巴坦是在相同的临床指南下进行给药，因此将这些抗生素的使用作为单一变量进行分组。这些模型中表现最好的模型（AICc = 121.79；p = 4.06 * 10-8）包括作为随机效应建模的患者，并证实ICU 停留时间与上呼吸道微生物多样性之间呈负相关关系。此外，该模型显示SARS-CoV-2病毒载量对微生物多样性的负面影响以及钙卫蛋白水平与SDI之间的正相关关系（图1c，d；补充图1b–d）。

　　我们利用筛选中生成的所有模型，进一步计算了所有固定效应的加权重要性评分（见方法；补充图1e）。这些评分表明，纳入最佳模型的三个变量（ICU时间、SARS-CoV-2病毒载量和钙卫蛋白水平）的相对重要性最高，其次是CRP水平和机械通气。抗生素头孢曲松、美罗培南或哌拉西林联合他唑巴坦治疗的重要性评分最低，美罗培南/哌拉西林联合他唑巴坦给药前后获得的样本之间未发现SDI的显著差异（补充图1f）。

　　综上，我们的数据表明，呼吸道微生物群多样性与ICU住院时间、SARS-CoV-2病毒载量和钙卫蛋白水平相关。该队列中，虽然我们并未发现抗生素的使用具有显著性影响，但我们不能排除抗生素给药或其他临床实践会导致SDI随时间而降低的可能。

　　进一步，我们在属水平上探究了上呼吸道微生物群组成和研究中收集的广泛宏数据之间的潜在相关性。总的来说，我们共测定了包括与患者人体测量学、药物以及在医院测量的临床变量相关的协变量，以及SARS-CoV-2病毒载量、宿主细胞因子表达和在拭子中测量的免疫细胞群（补充数据1）在内的72个协变量。在单变量分析中，这些协变量中有20个协变量与微生物群组成之间显著相关（dbRDA，p 0.05；FDR 0.05；图2a）。这些显著协变量与疾病及其严重程度指标相关，如患者的临床评价、ICU总住院时间、采样时ICU住院天数或患者所需的氧气支持类型。尽管SARS-CoV-2病毒载量与整体多样性之间具有相关性，但其与微生物群组成变异之间并未表现出显著的相关关系（补充数据1）。无论是目前正在使用何种类型的抗生素，还是正在使用多少种抗生素，均为表现出显著性关系，但特定抗生素美罗培南/哌拉西林-他唑巴坦（既往使用过或正在进行的使用）以及头孢曲松（仅正在进行的给药）给药与微生物群组成之间表现出显著性相关（补充数据1，图2a）。

　　图2 COVID-19的上呼吸道微生物组协变量。a代表能够显著解释该队列（n = 101，dbRDA）上呼吸道微生物群变异的协变量（p 0.05），其中单个协变量列在y轴上，其颜色对应于其所属的宏数据类别，图中较深的颜色表示假设独立的这些协变量中每一个协变量解释的个体方差，而较浅的颜色代表使用逐步dbRDA分析将每个变量纳入模型解释的累积和非冗余方差；黑色水平线将顶部非冗余分析中重要的变量（患者ID和氧气支持类型）与其余部分分开；b代表显示前两个约束轴的RDA排序图，其中排序受到两个重要变量“患者ID”和“氧气支持”的限制，图中的点代表所采集的样本，其颜色表示患者的氧气支持类型，形状表示在采样期间患者所处位置（在ICU中还是在病房中），图中两个轴表示dbRDA分析的前两个约束分量解释的方差；c代表样品在种（左）和菌株水平（右）的多样性，图中按氧气支持类型进行分层（n = 101个样品）；d表示不同氧支持类别样本在种水平和菌株水平上平均多样性之间的Pearson相关性分析，图中显示了两个变量之间线和p值（双侧F检验）；e代表不同氧支持类型的分类群丰度存在显著差异（n = 101个样本），图中红色代表有创通气，蓝色代表无创通气样本，并显示了两者之间之间具有差异的丰度类群。根据其BH值对p值进行调整，仅显示前10个最显著分类群。箱形图跨越数据分布的第一四分位数至第三四分位数，水平线表示数据的中位值。须线从四分位数延伸至四分位距1.5倍内的最后一个数据点，离群值超过四分位距，此外，图中还显示了单个数据点。灰色线连接在不同时间点采集的同一患者样本。*表示在控制主要抗生素（头孢曲松和美罗培南/哌拉西林-他唑巴坦）后仍显著的分类群。

　　在多变量分析中，这20个具有显著性的协变量中仅患者ID和采集样本时接受的氧气支持类型这2个协变量解释了该数据集中48.7%的非冗余变异（dbRDA；p = 0.001），而其余变量保留冗余信息。其中患者ID被纳入范畴是由于需要对患者进行纵向样本采样，并用于证实个体内随时间的变化小于患者个体间的变化（图2a、b）。值得注意的是，基于不同通气方式的氧气支持类型可对不同样本进行区分，其中无创通气样本（第1、2和3组）与插管患者样本（第4-7组）分离（PERMANOVA检验，R2 = 0.0642，p = 0.001）。基于这种分离，我们进一步评价了既往机械通气（不考虑特定组）是否会对微生物群组成造成显著影响，通过分析我们发现，既往机械通气表现出比仅考虑正在进行的机械通气产生更大的影响效果（PERMANOVA检验，R2 = 0.0965，p = 0.001），这表明这种侵入性操作可能产生长时间的影响。

　　机械通气本质上与其他临床实践相关，如给予广谱抗生素或进行去污程序（包括氯己定清洗）以预防/治疗呼吸机相关性肺炎。因此，我们探索了抗生素的使用是否可以解释微生物群组成和氧支持类型之间的显著关系。我们发现，从与微生物群组成相关的特定抗生素来看，头孢曲松主要用于接受无创通气患者（卡方检验，p = 0.001），而美罗培南或哌拉西林-他唑巴坦则优先用于接受机械通气的患者（卡方检验，p = 0.002；补充图2a）。这种相关性并不是偶然发生的，UZ Leuven大学医院现行治疗指南就曾指出：患者入院时给予头孢曲松3-7天，可以预防潜在的细菌合并感染。在我们的队列中，80%的患者在住院开始时接受了头孢曲松治疗（补充图2b）。ICU住院时间较长且需要较高水平氧气支持的患者将被视为患有医院获得性/呼吸机相关性肺炎（HAP/VAP），并接受美罗培南或哌拉西林/他唑巴坦联合治疗（补充图2b）。因此，疾病的严重程度和ICU住院时间可用于解释本研究所观察到的氧支持类型与这些抗生素之间的相关性。

　　因此，我们进一步探究了仅氧支持类型所产生的影响，我们采用部分dbRDA解构患者ID和两个显著的抗生素协变量，以提取仅氧支持的效应量。去基础模型显示出与整体微生物群组成之间的显著性相关关系（部分dbRDA；R2 = 0.058，p = 0.042），这一结果表明，尽管抗生素给药可以解释观察到的微生物群组成的部分变异，但这可能表现在独立于氧支持类型之外的影响。然而，伴随着机械通气进行的其他实践（如使用氯己定清洗液进行口腔去污）所产生的影响（这些操作与机械通气总是同时进行），因此不能独立于机械通气而进行评估。

　　进一步我们在种或菌株的水平上进行评估，以在更精细的分类学水平上探究氧支持或相关实践对微生物群落所产生的影响。基于分析，我们发现，即使是使用无创通气（例如，BIPAP、CPAP），通气也会改变菌种或菌株水平的多样性。在通气之前，我们在所有样本中观察较高的菌种以及较低的菌株多样性，但无论是那种形式的通气（除了吸入一氧化氮的通气之外），均使得这种多样性出现相反的变化，即通气之后表现出较低的菌种多样性以及较高的菌株多样性（图2c；Wilcoxon检验；p 0.05，7型除外）。此外，种和菌株水平上的多样性之间表现出很强的负相关关系（图2d；Pearson相关性，R2 = -0.92，p = 0.0035）。

　　鉴于我们所观察到的机械通气对微生物群落组成整体的影响，我们评价了插管和非插管患者样本之间具有差异丰度的特定分类群。总计28个细菌属在机械通气患者样本中较为丰富，而1个细菌属在无创通气患者中较为丰富（p 0.05；FDR 0.05；图2e，补充图3a；补充数据2）。当调控抗生素头孢曲松和美罗培南/哌拉西林的影响时，两组样本之间有20个菌属存在显著差异（补充图3b，补充数据2）。其中一些分类群是常见的口腔微生物组共生菌或条件致病菌，在已有的诸多研究中，相较于对照组，这些微生物类群在COVID-19患者中更丰富，这些微生物类群包括普雷沃菌属（Prevotella）、梭杆菌属（Fusobacterium）、卟啉单胞菌（Porphyromonas）或乳酸杆菌属（Lactobacillus）。本研究中我们发现，与非机械通气的COVID-19患者相比，在机械通气的COVID-19患者中，这些菌属的丰度更高。这表明机械通气（以及相关的实践操作，如口腔去污）是既往COVID-19研究的潜在混杂因素。此外，我们发现了先前COVID-19微生物组研究中未报告的但却与呼吸机相关性肺炎风险相关的其他分类群，如支原体（Mycoplasma）或巨球形菌属（Megasphaera）（图2e，补充图2）。

　　通过提取对应于这些差异丰富属的扩增子序列变体（ASVs）（见方法），其中一些分类群可以精细到种水平，证实其来源为典型的口腔细菌：例如，普雷沃菌属包括P. oris、唾液普雷沃菌（P. salivae）、栖牙普雷沃菌（P. denticola）、口颊普氏菌（P. buccalis）和口腔普雷沃菌（P. oralis）。在支原体属中，ASVs被归类为其他菌种中的唾液支原体（Mycoplasma salivarium）--一种与呼吸机相关肺炎发生相关的口腔细菌。当调控通气类型时，未发现与SARS-CoV-2病毒载量相关的分类群（补充数据2）。这些结果表明，需要更大的队列来进一步研究并调控本研究目前所强调的相关混杂因素，如通气类型、抗生素使用或ICU住院时间等，以进一步探究病毒感染的具体影响。

　　接下来，我们探索了肺微生物群紊乱所引起的功能结果（疾病或治疗驱动）的原因。为此，我们筛选了35例患者支气管肺泡灌洗（BAL）样本产生的宿主单细胞RNA-seq数据，以对微生物reads进行鉴定（见方法）。该横断面队列中的所有患者均表现出肺炎的临床症状，其中22例被诊断为COVID-19，其他13例非COVID-19肺炎人群被定义为对照组（表1）。在对35例患者在采样时，有21例入住ICU（包括20例COVID-19患者和1例对照患者），其余14例在病房住院（包括2例COVID-19患者和12例对照；表1和补充图4）。我们从这些样本中平均得到了7295.3个微生物reads/样本（范围从0到74,226个reads，只有一个样本产生零个微生物read；补充图4）。

　　在这些患者中主要优势分类群中，我们发现与鼻咽拭子中获得的数据相似。检出的前15位菌种包括唾液支原体--5例入住ICU的COVID-19患者的主要分类群，以及不同的普雷沃菌成员。入住普通病房（即非机械通气）的非COVID-19肺炎患者携带不同的微生物：2例患者的微生物组以牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）为主，而1例患者的微生物组以真菌耶氏肺孢子菌（Pneumocystis jirovecii）为主--一种引起肺孢子菌肺炎（Pneumocystis pneumonia，PCP）的已知病原体。

　　随后，我们利用单细胞条形码的优点（具有提示自由生活状态的独特条形码），并提出疑问--我们鉴定的微生物reads是否与宿主细胞相关（例如感染或内化）。总体而言，我们共鉴定到29,886个唯一条形码，并匹配到总计46,151个微生物UMI。但这些条形码的UMI分布并不具有均一性，其范围从1到201不等，与此同时，我们发现有88%的条形码仅具有单个UMI。此外，有26,572个条形码（89%）与单一微生物菌种相关，其余的条形码与2个菌种（8.8%）或更多菌种（2.2%）相关。

　　在总共29,886个微生物条形码中，只有2,108个同时被分配到宿主细胞中，这表明在BAL样本中发现的大部分细菌以自由生活的有机体或生物膜的形式存在。尽管需要通过显微镜评价来验证这一假设，但在先前的研究中，在支气管肺泡灌洗液中曾记录到细菌生物膜的存在。然而，对于与宿主细胞相关的细菌部分，不同疾病类型的分布并不具有随机性。我们发现，虽然有2.3%的非COVID-19患者细胞与细菌相关，但在COVID-19患者中能够观察到更多的与细菌相关的细胞（近乎是两倍，约4%）（图3a；卡方检验；p = 3.75*10-35）。但是，由于在该队列中COVID-19诊断与机械通气高度相关，该效应可能是由于COVID-19患者的插管率较高所导致，并且也可能是高VAP发病率所导致。在COVID-19患者中，我们还评估了细菌相关宿主细胞和检测到SARS-CoV-2 reads的细胞之间的重叠（附表2）。在COVID-19患者中检测到的与细菌相关的1033个宿主细胞和检测到SARS-CoV-2 reads的343个细胞中，只有一个细胞的病毒和细菌reads均为阳性。在同一宿主细胞中病毒和细菌检测独立性的二项式检验表明，观察到仅在一个细胞中同时出现的可能性极低（p = 5.7*10-4），这些结果表明，在同一宿主免疫细胞中微生物组成员和病毒相互排斥。然而，必须注意的是，本研究中的未检测并不一定意味着缺乏细菌/病毒与宿主细胞的关联，这在与单细胞RNAseq等实验方法相关联的研究中尤需值得注意，因为这些方法的设计用于分析宿主细胞，并没有针对这些实体的检测进行优化。因此，需要更大样本量的进一步研究来验证共排除假设。

　　考虑到COVID-19患者和对照组患者中细胞类型的频率不同，我们还探索了宿主相关细菌reads是否优先与特定细胞类型相关联（见方法）。这种优先关联表明这些观察结果具有生物学相关性，而不是单细胞样品和文库制备的假象。在对照患者中，两组的细胞类型分布相似，微生物细胞仅优先与中性粒细胞结合（p = 3.61*10-12；图3b；补充图4）。然而，在COVID-19患者中，三种细胞类型与细菌显著相关：中性粒细胞（p = 8.27*10-29）、单核细胞（p = 4.82*10-5）和单核细胞源性巨噬细胞（p = 2.23*10-51；图3b；补充图5和补充数据3）。此外，不同的细菌与不同的宿主细胞相关联。例如，在COVID-19患者中，支原体属的细菌优先与单核细胞源性巨噬细胞相关（p = 2.28*10-7），而罗斯氏菌属（Rothia）（p = 8.21*10-4）、肠杆菌属（Enterobacter）（p = 2.59*10-5）或克雷伯菌属（Klebsiella）（p = 3.12*10-9）在单核细胞中富集（图3c，补充数据3）。

　　图3 与下呼吸道微生物群相关的宿主单细胞。a代表在阴性（n = 31923个细胞）和阳性（n = 33243个细胞）COVID-19患者中，与细菌相关（红色）以及与细菌无关（蓝色）的细胞的相对比例，其中顶部的p值代表基于双尾卡方检验结果；b代表细菌相关细胞中富集的细胞类型，柱状图代表COVID-19阳性和阴性患者中与细菌无关的（“否”；n = 63,463个细胞）以及与细菌有关的（“是”；n = 1,703个细胞，其中共检测到2108个细菌）细胞类型的比例；c代表优先与特定细胞类型相关的细菌属，其中热图显示了对照组（左）和COVID-19阳性患者（右）的双尾卡方检验的标准化残差，这其中包括了所有细菌属和细菌中富集的三种宿主细胞类型，与任何细胞类型无显著相关性的Taxa未在图中进行展示，此外，图中红色代表富集，蓝色代表耗竭；d代表与细菌相关的宿主细胞亚型。热图显示了双尾卡方检验的标准化残差，这其中包括具有相关细菌的中性粒细胞、单核细胞和单核细胞源性巨噬细胞亚型，并将无细菌的细胞作为背景，图中红色代表富集，蓝色代表耗竭；e代表检测到5种不同亚型中性粒细胞的标记基因，这表明出细菌相关的细胞与非细菌相关的细胞之间的组内差异；f代表典型促炎性表达的髓系细胞功能基因集，两种亚型骨髓细胞的抗炎和MHC编码基因与细菌显著相关（CCL2hi-巨噬细胞和IL1Bhi-单核细胞），此外，热图还显示了细菌相关细胞和非相关的细胞之间的组内差异。图中*，**，***，****分别代表p在0.05，0.01，0.001以及0.0001水平上具有显著性差异，具体精确的数据详见补充数据3。

　　最后，我们探究了细菌与宿主细胞的关联是否与宿主细胞表达有关。为此，我们评估了中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞基于表达的细胞亚型分类在该队列的所有样本中是否显示与细菌的非随机相关性。在中性粒细胞中，以钙粒蛋白S100A12基因表达为特征的炎性中性粒细胞亚型富集在细菌相关细胞中（卡方双侧检验，p =7.18*10-6；图3d-e；补充数据3）。此外，该亚群细胞富集在SARS-CoV-2核衣壳基因reads中，这表明负责防御病毒的相同细胞类型将对肺中潜在的侵袭性细菌作出响应。该亚组的特征是S100A8和S100A9编码的钙卫蛋白亚基的表达。已有的研究表明，S100A8/A9异源二聚体分泌在感染诱导的炎症中增加，并通过促炎性细胞因子的分泌、活性氧的释放和其他炎症细胞的募集，以及细菌酶活性所必需的Zn2+的螯合介导具有一定的抗菌作用。这些机制是通过S100A8/A9二聚体与TLR4受体结合进而触发促炎性细胞因子的释放所介导的，因此这可能有助于维持或加重炎症反应。因此，与细菌的关联至少可以部分解释这种中性粒细胞亚群的炎症表型。为了进一步验证这一假说，我们探索了细菌相关和非相关S100A12hi中性粒细胞之间的差异基因表达（补充数据4）。鉴于这些细胞与SARS-CoV-2之间的联系和这些细胞与细菌之间的联系是相互排斥的，我们也将这些变化与病毒在中性粒细胞中触发的变化进行了比较。在这个亚群中，共存细菌的中性粒细胞表现出促炎基因的显著高表达（p 0.05），这包括细胞因子IL1B及其一些靶基因（PTSG2）、FOS和JUN编码的转录因子以及编码细胞脱粒相关蛋白的几个基因（S100A9、FOLR3、HSPA1A，HSP90AA1，FCGR3B）（补充数据4）。其中，编码叶酸受体的基因FOLR3存在于中性粒细胞分泌颗粒中，通过结合叶酸盐，从而使细菌丧失掉其必需的代谢产物，进而表现出抗菌功能。由于IFN反应基因不被细菌明显上调，因此这种反应与吞噬病毒的中性粒细胞不同。

　　就骨髓细胞而言，炎性IL1Bhi单核细胞（p 2*10-16）以及表达CCL2的巨噬细胞混合组（p = 5.38*10-10）均富集在与细菌相关细胞中（图3f）。这些炎性单核细胞被认为在重度COVID-19患者发生的异常免疫应答中发挥着重要的作用。在这种情况下，我们进一步检测了其基因的表达模式，对于CCL2hi巨噬细胞而言，与细菌共存的细胞表达更高水平的I型和II型MHC基因，表明这些细胞在抗原呈递中表现出更为积极的作用（p 0.05；图3f；补充数据4）。在单核细胞中也观察到相似但不显著的增加（补充数据4），这可能是由于该数据集中单核细胞丰度较低。此外，与中性粒细胞相似，细菌相关巨噬细胞表达显著更高水平的钙卫蛋白亚基基因S100A8/A9，以及编码促炎趋化因子的基因（如CCL4、CXCL10和CXCL1）。

　　综上，我们的结果表明，通过scRNA-seq分析在这些细胞亚群中检测到的细菌可能有助于在宿主中观察到的炎症反应。

　　自COVID-19大流行开始以来，科学界在全球范围内进行了诸多努力，以了解SARS-CoV-2感染的生理病理学和影响疾病结局的风险因素。本研究中，我们探究了呼吸道微生物群作为疾病严重程度的潜在风险因素，并在整个住院期间评估了COVID-19患者的上呼吸道以及下呼吸道微生物群。我们将这些数据与nCounter和单细胞RNA测序数据的病毒载量测量和免疫分析结果相关联。此外，为了评估既往报告信号的稳健性，我们基于广泛的患者宏数据变量组研究了潜在混杂因素的影响。

　　我们发现在上呼吸道中，SARS-CoV-2病毒载量与细菌生物多样性呈轻度负相关关系。而严重程度指标（如钙卫蛋白水平或ICU住院时间）对细菌生物多样性具有更大的影响，随着入住ICU时间的延长，患者细菌多样性逐渐降低，这种模式与在其他肺部疾病中观察到的模式相似。治疗选择可能介导了ICU住院时间的影响，如给予广谱抗生素治疗或患者接受插管或机械通气。由于抗生素的使用能够降低整体微生物的多样性，包括可能与炎症相关的分类群，这也恰恰解释了为什么钙卫蛋白水平与α多样性相关。先前的就COVID-19患者微生物群多样性的研究显示出一些相矛盾结果：一些研究表明COVID-19患者痰液或咽拭子样本的多样性较低，而其他使用支气管肺泡液样本关注下呼吸道微生物群的研究则表明，COVID-19患者的细菌多样性高于对照患者。本研究中我们观察到的这些临床实践对微生物群α多样性的影响恰恰可能解释了上述矛盾产生的原因。尽管如此，我们仍不能排除采样部位或处理也可能是这些研究中的潜在混杂因素。

　　进一步研究发现，不同严重程度指标（患者的临床状态，所接收的氧气支持类型等）也会影响患者之间的微生物群变异（通过属水平微生物β多样性测定），其中机械通气患者的微生物群有别于非插管患者。这种影响既不能用一般抗生素给药也不能用特定抗生素的使用来完全解释，这表明机械通气所产生的独立影响。在小队列研究中也曾提出过这种独立的效应，但仍需要在更大规模的研究中进行验证。然而，诸如插管过程中伴随的去污程序等其他相关实践，仍可能是目前观察到的相关性的原因，由于COVID-19严重程度决定了需要进行的临床处置方式，这使得我们不能完全排除疾病严重程度的混杂效应。氧支持的影响也反映在种和菌株水平，插管分别引起多样性的显著降低和增加。综上所述，这些结果表明，无创通气（如BIPAP、CPAP）可以产生微生物效应表明任何形式的通气都可能是微生物群落差异的临界点。

　　既往COVID-19微生物群的研究表明，在插管和非插管患者之间变化的几个分类群与患者接受的诊断相关。在我们的研究中，在控制了机械通气后，并未发现有与SARS-CoV-2病毒载量特异性相关的分类群。该结果表明，机械通气及其相关临床实践存在混淆既往结果的可能性。事实上，一项对诊断为社区获得性肺炎的COVID-19患者的比较研究发现，两组患者的呼吸道微生物群组成无差异，但两组均与健康对照组存在差异。这些结果表明，在研究上呼吸道微生物群时，患者插管甚至无创通气，以及其相关的医疗实践被认为是重要的混杂因素，我们强烈建议未来的COVID-19微生物群研究应该预见并对这个协变量进行合理的解释。例如，最近的一项研究通过与之前在ICU患者中进行的微生物群研究进行比较，在控制了ICU相关的混杂因素后，发现了与罗斯氏菌属属相对应的单一ASV，其对SARS-CoV-2患者具有特异性。此外，这些关于微生物群变异的潜在驱动因素的发现并非COVID-19疾病所独有：插管对呼吸道微生物群的影响及其对呼吸机相关性肺炎发病率的影响之前已有研究。

　　为了更好地理解这些程序的潜在功能后果和相关的微生物变化，我们还使用从同一医院患者的横断面队列中获得的单细胞数据对下呼吸道的微生物群进行了分析。我们的结果表明，单细胞RNA-seq，尽管没有被优化用于微生物检测和分析，但可以对单独的细菌或是与人类细胞相关的细菌进行鉴定。在本研究队列中，我们确定了与宿主细胞相关的细菌亚群（中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞）。虽然与中性粒细胞的相关性在COVID-19患者和对照组中均有发现，但与单核细胞和巨噬细胞的相关性是COVID-19患者所特有的。这种富集表明，这些细菌可能不是随机污染物，由此可以预期跨细胞类型的均匀分布（即考虑细胞类型丰度）。这些宿主细胞的亚型表明，细菌可能被这些先天性免疫系统细胞吞噬，而不是附着在宿主细胞表面。据我们所知，这是首次通过高通量单细胞RNA-seq将相互作用的宿主细胞和肺微生物群联系起来的研究。

　　我们发现与细菌相关的宿主细胞，其中大多数都来源于口腔，同时表现出促炎表型以及用于抗原呈递的高水平MHC。在该单细胞队列中，观察到危重COVID-19患者的特征为单核细胞向巨噬细胞的分化受损，导致促炎性单核细胞的积累，以及中性粒细胞炎症的延长。鉴于只有这些细胞类型富集在细菌中，我们假设，呼吸道（或通气相关）微生物群可能在加剧下呼吸道COVID-19进展中发挥作用。我们验证了这种反应可能是由细菌驱动而非SARS-CoV-2。尽管我们在相同细胞中没有检测到重叠的病毒和细菌，但必须注意的是，这并不能完全排除这些细胞内同时存在病毒和细菌。因此，需要进一步的研究来证实微生物群在这种危重疾病特征性的免疫损伤中的致病作用，并揭示其中的具体机制。

　　肺菌群中口腔分类群的存在并不是疾病条件所特有的。众所周知，发生在健康人中的微吸入或起源于口腔的气溶胶液滴的吸入，可作为口腔共生菌肺部定植的途径。当重症患者（包括但不限于COVID-19）进行插管时，可促进口腔细菌在下呼吸道的增加。事实上，口腔细菌与呼吸机相关性肺炎有关。目前尚未阐明COVID-19生理病理学是否有利于口腔细菌的肺部定植，或是不利于其定植。已知的是，下呼吸道口腔细菌的增加可导致炎症表型的增加，即使在健康受试者中。

　　总体而言，本研究对COVID-19微生物群研究中的潜在混杂因素进行了系统分析。我们发现，ICU住院和氧支持类型（可能至少部分由临床实践解释，如抗生素使用）对上呼吸道微生物组有较大影响，并有可能混淆临床微生物群的研究。在不同类型的氧支持中，我们报告了插管和非插管患者之间微生物群落结构的最大变化。我们发现口腔分类群在机械通气COVID-19患者上呼吸道中显著富集，在COVID-19患者下呼吸道中也发现了特定的分类群。此外，在下呼吸道中，微生物与特异性促炎性免疫细胞密切相关。这些信息有助于汇集关于COVID-19病理的文献，并提示在评估肺微生物群对COVID-19疾病的作用时，应特别注意入住ICU时间和氧气支持的类型以及相关的临床实践（如抗生素的使用或口腔去污程序）。